【原理】

　　Southern 印跡是將電泳分離的 DNA 片段轉移到一定的固相支持物上的過程。

　　DNA 分子經限制性核酸內切酶酶切，經瓊脂糖凝膠電泳將得 DNA 片段按分子量大小分離，然后將含 DNA 片段的瓊脂糖凝膠變性，并將單鏈 DNA 片段轉移到硝酸纖維素膜或其它固相支持物上，而各 DNA 片段的相對位置保持不變，這種濾膜可用于雜交反應。利用 Southern 印跡法可進行克隆基因的酶切圖譜分析、基因組基因的定性及定量分析、基因突變分析及限制性片段長度多態性分析 (RFLP)等。

　　【操作】

　　(1)取一定量的待測 DNA 樣品，用適當的限制性內切酶酶切。DNA 的量根據樣品的種類及目的的不同而異，對于克隆片段的限制性內切酶圖譜分析，取 0.1 ～ 0.5 μ g 即可；而對于鑒定基因組 DNA 中的單拷貝基因順序，則需要 10 ～ 20μg ；當采用寡核苷酸探針或探針的比放射性活性較低時，則需要多至 30 ～ 50 μ g 。酶切完畢，在瓊脂糖凝膠中電泳，在其中 1 孔中加入適當的 DNA 分子量標準參照物。電泳結束后，溴化乙錠 (EB)染色，長波紫外線下觀察電泳結果，用 1 張保鮮膜覆蓋在凝膠上，復制下各分子量參照物及各 DNA 樣品帶的位置，在凝膠旁置 1 標尺照像。

　　(2)切除無用的凝膠部分。將凝膠的左下角切除，以便于定位，然后將凝膠置于一搪瓷盒中。

　　(3)將凝膠浸泡于適量的變性液中，室溫下放 1 小時使之變性，不間斷地輕輕搖動，對于較大的 DNA 片段 (如大于 15kb)，可在變性前用 0.2mol / L HCl 預處理 10 分鐘使其脫嘌呤后，再進行堿變性處理。

　　(4)將凝膠用去離子水漂洗 1 次，然后浸泡于適量的中和液中 30 分鐘，不間斷地輕輕搖動。換新鮮中和液，繼續浸泡 15 分鐘。

　　(5)如圖 8-1 所示，在一塑料或玻璃平臺上鋪一層 Whatman 3mm 濾紙，此平臺要求比凝膠稍大。將此平臺置于一搪瓷盒或玻璃缸中，搪瓷盒中盛滿 10 × SSC 。濾紙的兩端要完全浸沒在溶液中，將濾紙用 20 × SSC 濕潤，用一玻璃棒將濾紙推平，并排除濾紙與玻璃板之間的氣泡。

　　(6)裁剪一塊與凝膠大小相同或稍大的硝酸纖維素膜。注意操作時要戴手套，千萬不可用手觸摸，否則油膩的膜將不能濕潤，也不能結合 DNA 。

　　(7)將硝酸纖維素濾膜漂浮在去離子水中，使其從底部開始向上完全濕潤。然后置于 20 × SSC 中至少 5 分鐘。注意濾膜如果不能被濕潤則不能用。

　　(8)將浸泡好的凝膠上下顛倒后，置于上述鋪了一層 Whatman 3mm 濾紙的平臺中央。注意兩者之間不要有氣泡。

　　(9)在凝膠的四周用 Parafilm 蠟膜封嚴，以防止在轉移過程中產生短路 (轉移液直接從容器中流向吸水紙而不是經過凝膠 )，從而使轉移率降低。

　　(10)將濕潤的硝酸纖維膜小心覆蓋在凝膠上，膜的一端與凝膠的加樣孔對齊。排除兩者之間的氣泡。相應地將膜的左下角剪去。注意膜一經與凝膠接觸即不可再移動，因為從接觸的一刻起，DNA 已開始轉移。

　　(11)將兩張預先用 2 × SSC 濕潤過的與硝酸纖維素膜在大小相同的 Whatman 3mm 濾紙覆蓋在硝酸纖維素膜上，排除氣泡。

　　(12)裁剪一些與硝酸纖維素膜大小相同或稍小的吸水紙，約 5 ～ 8cm 厚。將之置于 Whatman 3mm 濾紙之上。在吸水紙之上置一玻璃板，其上壓一重約 500g 的物品。

　　(13)靜置 8 ～ 24 小時使其充分轉移，其間換吸水紙 1~2 次。

　　(14)棄去吸水紙和濾紙，將凝膠和硝酸纖維素膜置于 1 張干燥的濾紙上。用軟鉛筆或圓珠筆標明加樣孔的位置。

　　(15)凝膠用溴化乙錠染色后紫外線下檢查轉移的效率。硝酸纖維素膜浸泡在 6 × SSC 溶液中 5 分鐘，以去除瓊脂糖碎塊。

　　(16)硝酸纖維素膜用濾紙吸干。然后置于兩層干燥的濾紙中，真空下 80 ℃烘烤 2 小時，此過程使 DNA 固定于硝酸纖維素膜上。

　　(17)此硝酸纖維膜即可用于下一步的雜交反應。如果不馬上使用，可用鋁箔包好，室溫下置干燥處保存備用。

　　(18)如用于雜交，雜交方法見實驗三十二。

　　【器材】

　　瓊脂糖電泳裝置：真空泵；真空烤箱；其它實驗室常規儀器及試劑。

　　【試劑】

　　適當的限制性核酸內切酶

　　瓊脂糖

　　變性液： 1.5mol/LNaCl ； 0.5mol / L NaOH 。

　　中和液： lmol / L Tris-Cl （pH8.0 ）； 1.5mol / L NaCl 。

　　轉移液（20 × SSC ）： 3mol / L NaCl ； 0.3mol / L 檸檬酸鈉，pH7.0 。

　　硝酸纖維素膜或尼龍膜