Gateway技術提供以下可能： 通過去除冗長的亞克隆步驟節省您的時間

　　同時將您的基因轉移到多個表達系統

　　在任何您選擇的系統――體外，細菌，酵母，昆蟲，或哺乳動物――分析表達

　　一、一種更好的克隆方法

　　Gateway技術能夠克隆一個或多個基因進入到任何蛋白表達系統（圖1）。這項強大的體外技術大大地簡化了基因克隆和亞克隆的步驟，而同時典型的克隆效率高達95%或更高。當基因在目的表達載體之間快速簡便的穿梭時，還可以保證正確的方向和閱讀框。Gateway也有助于進行帶不同數目純化和檢測標簽蛋白的表達。

　　圖1 Gateway技術的靈活性

　　目的基因克隆進入門載體后，可以同時轉移目的基因到多個目的載體。

　　Gateway利用了位點特異重組，所以在構建入門載體后，不再需要使用限制性內切酶和連接酶。一旦您擁有了一個入門克隆，就可以多次使用它，轉移您的目的基因到Gateway改造過的各種表達載體（目的載體）。

　　此外，由于在重組時DNA片段的閱讀框和方向保持不變，因而您不必再為新的表達克隆測序擔心。在使用每一種新的表達系統時，將會節省您更多的時間。

　　二、一項強大而可靠的技術

　　Gateway技術是克隆和亞克隆DNA序列的一項新穎的通用系統，便于功能基因的分析和蛋白質的表達。一旦進入這個多功能的操作系統，DNA片段可以通過位點特異的重組在載體之間轉移。

　　Gateway技術是基于已研究的非常清楚的λ噬菌體位點特異重組系統（attB x attP →attL x attR）。BP和LR兩個反應就構成了Gateway技術（表1和圖2）。BP反應是利用一個attB DNA片段或表達克隆和一個attP供體載體之間的重組反應，創建一個入門克隆。LR反應是一個attL入門克隆和一個attR目的載體之間的重組反應。LR反應用來在平行的反應中轉移目的序列到一個或更多個目的載體。

　　在BP反應中基因轉移形成入門克隆，在LR反應中入門克隆可以作為反應物產生最終的表達克隆。

　　完成構建Gateway表達克隆僅需兩步（圖2）：

　?。?）創建入門克隆，通過PCR或傳統的克隆方法將目的基因克隆進入門載體。

　?。?）混合包含目的基因的入門克隆和合適的目的載體以及Gateway LR Clonase酶，構建表達克隆。（表達克隆用來在合適的宿主中進行蛋白的表達和分析。）

　　有幾種方法可以構建Gateway入門克隆。無論您選擇何種方法，創建的入門克隆都是準備用來與各種目的載體進行重組。

　?。?）PCR克隆（定向TOPO克隆至入門載體或與供載體B×P重組）

　?。?）限制性內切酶消化和連接進入入門載體

　　（3）使用pCMV?SPORT6或pEXP-AD502*構建Gateway兼容cDNA文庫

　?。?）Gateway改造過的克隆資源*

　　* 這些克隆資源和cDNA文庫兩邊加有attB位點。這些克隆可以通過與供載體及BP Gateway酶反應轉換到入門載體。獲得已有克隆資源的更多信息。

　　三、PCR定向（PCR-Directional）TOPO克隆

　　定向TOPO克隆使得克隆PCR產物和其它的DNA分子更加快速和有效。進行5分鐘的簡單連接，產生>90%的重組子。您不僅會比用連接酶介導的方法更快的獲得克隆，而且可以節省因第一次無結果而重復試驗所額外浪費的時間。

　　定向TOPO克隆提供高效的一步法克隆策略，可以定向克隆平端PCR產物到入門載體。平端PCR產物定向克隆的效率>90%，從而簡化了篩選。同時不再需要連接酶、PCR后續步驟或者限制性內切酶。

　　四、構建入門載體的各種選擇

　　1、限制性內切酶消化

　　作為PCR克隆的替代方法，有5種Gateway入門載體可以使用傳統的限制酶切和連接的方法產生入門克隆。這些載體配合合適的目的載體，可以用于表達天然蛋白或帶有N端或C端融合標簽的重組蛋白。為了在真核細胞中有效地翻譯蛋白，所有的5個Gateway入門載體提供了Kozak 序列。此外，pENTR11提供了SD （Shine-Dalgarno）序列，便于在大腸桿菌中有效的翻譯。

　　2、PCR重組克隆

　　重組是從PCR產物創建Gateway入門克隆的另一種方法。這種方法是通過合并attB位點到上游和下游引物上，然后共同孵育PCR擴增產物和pDONR載體（包含attP位點）以及Gateway BP Clonase酶混合物。接著轉化進大腸桿菌中，您將會獲得包含目的基因的入門克隆，同時目的基因兩側具有attL重組位點。這個入門克隆可以與任何Gateway目的載體進行重組（參看圖2）。

　　3、Gateway改造過的cDNA文庫

　　如果您已經有了用Gateway兼容載體構建的cDNA文庫，您就可以通過pDONR載體和BP Clonase酶混合物進行一個簡單的重組反應，很容易地把單個克隆轉換成Gateway入門克隆。這樣就不再需要亞克隆和測序，為您節約數小時的時間。

　　SuperScript cDNA文庫使用pCMVSPORT構建，有幾種人組織來源可供選擇，這些文庫有很大一部分是全長的插入片段，可以完全代表來源mRNA。

　　4、入門克隆的切入點——克隆資源

　　您可以從與10000個人類基因相關的35000個克隆中進行選擇，這些克隆的70%以上是全長序列的。這些克隆來源于使用特殊的高級cDNA文庫構建技術、oligo dT引物以及SuperScript II 反轉錄酶所構建的文庫。許多克隆來源于I.M.A.G.E.協會，NCI CGAP 項目，ResGen庫或UltimateORF庫。

　　克隆資源因為已克隆到Gateway改造過的載體，所以可以快速地將基因轉到各種表達系統中。