凝膠遷移或電泳遷移率實驗(EMSA)
凝膠遷移或電泳遷移率實驗(EMSA)是一種研究DNA結合蛋白和其相關的DNA結合序列相互作用的技術,可用于定性和定量分析。這一技術最初用于研究DNA結合蛋白,目前已用于研究RNA結合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。
其基本原理是蛋白質可以與末端標記的核酸探針結合,電泳時這種復合物比無蛋白結合的探針在凝膠中泳動的速度慢,即表現為相對滯后。該方法可用于檢測DNA結合蛋白、RNA結合蛋白,并可通過加入特異性的抗體(supershift)來檢測特定的蛋白質,并可進行未知蛋白的鑒定。
通常將純化的蛋白和細胞粗提液和32P同位素標記的DNA或RNA探針一同保溫,在非變性的聚丙烯凝膠電泳上,分離復合物和非結合的探針。DNA-復合物或RNA-復合物比非結合的探針移動得慢。同位素標記的探針依研究的結合蛋白的不同,可是雙鏈或者是單鏈。當檢測如轉錄調控因子一類的DNA結合蛋白,可用純化蛋白,部分純化蛋白,或核細胞抽提液。在檢測RNA結合蛋白時,依據目的RNA結合蛋白的位置,可用純化或部分純化的蛋白,也可用核或胞質細胞抽提液。競爭實驗中采用含蛋白結合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段(特異),和其它非相關的片段(非特異),來確定DNA或RNA結合蛋白的特異性。在競爭的特異和非特異片段的存在下,依據復合物的特點和強度來確定特異結合。
Lane 1 2 3 4 EBNA Extract - + + + Unlabeled EBNA DNA - - + - Unlabeled Oct-1 DNA - - - +
Figure . EMSA results using the EBNA control system. Biotin-labeled 60 bp duplex bearing the EBNA-1 binding sequence was incubated with an extract in which the EBNA-1 protein was overexpressed. The binding buffer was supplemented with 50 ng/μl poly(dI?dC), 10% glycerol and 0.05% NP-40. Exposure time was 30 seconds with X-ray film