隨著基因工程的發展，常常需要構建一種能高水平表達異源蛋白質的表達載體。啟動子對外源基因的表達水平影響很大，是基因工程表達載體的重要元件。因此研究啟動子的克隆方法，對研究基因表達調控和構建表達載體至關重要。

迄今為止，國外尚未見到有關啟動子克隆方法的綜述性報道，國內僅孫曉紅等曾就啟動子的結構、分類、克隆方法和食用菌中已經分離到的啟動子作過綜述。而近年來又有許多改進的克隆啟動子的方法獲得了多方面的成功，本文就近年來改進的啟動子克隆方法作一綜述，以期促進對啟動子分離技術的應用。

1　啟動子克隆的幾種方法

1.1　利用啟動子探針載體篩選啟動子

啟動子探針型載體是一種有效、經濟、快速分離基因啟動子的工具型載體，包含2個基本部分：轉化單元和檢測單元。其中，轉化單元含復制起點和抗生素抗性基因，用于選擇被轉化的細胞；檢測單元則包括1個已失去轉錄功能且易于檢測的遺傳標記基因以及克隆位點。

利用啟動子探針載體篩選啟動子的過程為，先選用1種適當的限制性核酸內切酶消化切割染色體DNA，然后將切割產生的DNA限制片段群體與無啟動子的探針質粒載體重組，并按照設計的要求使克隆的片段恰好插在緊鄰報告基因的上游位置；隨后再把重組混合物轉化給寄主細胞，構建質粒載體基因文庫，并檢測報告基因的表達活性。

當插入段同時滿足(1)具有基因啟動子序列；(2)具有翻譯啟始區；(3)具有啟始密碼子；(4)插入方向正確；(5)插入片段3'端編碼區序列抗性基因編碼區讀碼框一致，則有可能形成有功能的抗性融合基因，從而啟動抗性基因的表達。

最早由Rachael等在大腸桿菌中以四環素抗性基因作為報告基因構建了啟動子探針質粒pBRH3B，并克隆了一些原核和真核啟動子片段。其后Donna等以氯霉素抗性基因作為報告基因，Fodor等以大腸桿菌LacZ為報告基因，構建了酵母啟動子探針質粒并克隆了一些啟動子片段。構建啟動子探針型載體，較為常見的檢測標記基因有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)、氯霉素乙酰轉移酶基因(cat)、四環素抗性基因(Tet')和卡那霉素抗性基因(Kan')。

近年來，人們漸漸較多地使用潮霉素B磷酸轉移酶(hph)基因作為檢測標記基因。李維等曾構建了含有hph抗性基因的啟動子探針型載體pSUPV8，直接在大腸桿菌中分離黃孢原毛平革菌基因的啟動子。先用Sau3AI酶切黃孢原毛平革菌基因總DNA，再與用BamHI酶切后的pSUPV8相連，轉化大腸桿菌，用間接篩選法從氨芐青霉素和潮霉素抗性平板上篩選重組子，得到6個雙抗重組子(pCH1～pCH6)，電泳檢測插入片段分別命名為CHl～CH6；再用原生質體轉化法將重組子分別轉化黃孢原毛平革菌，對獲得的轉化子進行復篩，僅pCH6的轉化平板上有穩定生長的菌落，說明了CH6片段在黃孢原毛平革菌中具有啟動基因表達的功能。該方法不需要知道具體基因的序列，可隨機篩選啟動子，避免了引物設計，能獲得大量的啟動子片段。

1.2　利用PCR技術克隆啟動子

即根據發表的基因序列，設計引物，克隆基因的啟動子，由于PCR法簡便快捷，近年來人們較多采用此方法克隆基因啟動子。

蘇寧等根據已報道的水稻葉綠體16SrRNA啟動子基因序列設計5'啟動子序列的引物，以水稻葉綠體DNA為模板，PCR擴增出16SrRNA基因5'啟動子區的片段，酶切克隆到pSK的SacI和SphI位點，構建測序載體質粒pZ16S，進行序列測定，結果表明所克隆的片段長為144bp，含有SD序列。同源比較結果表明，所克隆的片段與水稻葉綠體16SrRNA啟動子序列具有100％的同源性。

上述的PCR方法簡便、快捷、操作簡單，是人們較為廣泛使用的技術。

1.3　環狀

PCR

環狀PCR包括I-PCR(Inverse-PCR)和P-PCR(Panhandle-PCR)。這2種PCR都是根據一端已知序列設計的嵌套式引物進行PCR。

1.3.1　I-PCR I-PCR是1988年由Triglia最早提出的一種基于PCR的改進的染色體步行方法。

I-PCR的實驗程序包括，基因組DNA經酶切后用T4DNA連接酶進行自連接，產生環狀DNA片段；以環化產物為底物，用根據已知片段設計的反向引物進行PCR擴增，從而得到含有未知片段的擴增產物(流程如圖1所示)。