重組PCR是利用PCR法在DNA片斷上進(jìn)行定點(diǎn)突變，用PCR介導(dǎo)產(chǎn)生核苷酸的突變包括堿基替代、缺失或插入。

引物設(shè)計(jì)

通常引物中至少有15個(gè)堿基與靶序列相互補(bǔ)，而靶序列的3'-末端可以與任何添 加序列發(fā)生錯(cuò)配，單個(gè)堿基錯(cuò)配除引物3'-末端處3-4個(gè)堿基外，其他地方都可引入。 在PCR產(chǎn)物之間提供重疊的添加序列至少要有15個(gè)堿基，當(dāng)然越和越好，這樣它將使 重疊的雜合分子穩(wěn)定。

原初PCR(PrimaryPCRs)

如上所述，為了避免非理想突變，應(yīng)該用盡可能多的模板DNA。但必須注意，帶 有或不帶有所需突變的PCR產(chǎn)物的量與起始模板的量成正比，而這些DNA又可帶入隨后 的重組PCR反應(yīng)中。若可能的話(huà)，這個(gè)比率可以通過(guò)純化“原初”P(pán)CR產(chǎn)物而教師到降 低。在達(dá)到“平臺(tái)期”(Plateau)之前，用盡可能少的PCR徨來(lái)產(chǎn)生足夠量的PCR產(chǎn)物 也是個(gè)好辦法。

從PCR中除去過(guò)量的引物

為了得到理想的組合PCR產(chǎn)物，必須從原初PCR產(chǎn)物中除去重疊引物或“內(nèi)側(cè)”引 物，然后加入“外側(cè)”引物。用Centricon100的選擇性過(guò)濾可以很容易地分開(kāi)PCR產(chǎn) 物和引物，具體操作如下:

1.在Centricon100貯樣器(Reservour)上部，將10-50μl原初PCR終產(chǎn)物加到 2mlTE(10mMTris-HClpH8.0，0.1mMEDTA)中，用石蠟?zāi)どw封，顛倒混勻。

2.1000g離心25分鐘，先濾出引物。再用大于1000g的速度離心。超過(guò)1000g的離 心力會(huì)使部分產(chǎn)物透過(guò)濾膜。再加入2mlTE到Centricon100中，重復(fù)離心。

3.重新懸浮PCR產(chǎn)物(大約40μl)

此外，PCR產(chǎn)物也可以用凝膠電泳來(lái)純經(jīng)，它有除去原初靶DNA的優(yōu)點(diǎn)。

重組PCR

將原初PCR產(chǎn)物混合后，重疊分子的生成及延伸將在PCR條件下發(fā)生。用盡可能多 的PCR產(chǎn)物，以限制DNA復(fù)制的倍增次數(shù)和減少非理想突變發(fā)生。如果可能的話(huà)，作為 一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)，應(yīng)確證外側(cè)引物確實(shí)從未突變的模板中擴(kuò)增了DNA片段(如果打算 事先將不相關(guān)的旬結(jié)合起來(lái)是不可能的)