MAPK激酶活性檢測
實驗概要
本實驗提供了一個MAPK激酶活性的檢測方法。
主要試劑
1uM f1g22，10uM flg22
0.02% Silwet L-77
液氮
蛋白提取緩沖液(100 mM Hepes, pH 7.5,5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 10mM DTT, 10 mM Na3VO4, ?10 mM NaF, 50 mM P-glycerophosphate, 1 mMphenylmethylsulfonyl fluoride, ?5 pg/mL antipain, 5 pg/mL aprotinin, 5 pg/mL leupeptin,10% glycerol, ?7.5% polyvinylpolypyrrolidone)
0.25 mg/mL myelin basic protein(MBP)
漂洗緩沖液(25mM Tris, pH 7.5, 0.5mM DTT,0.1mM Na3V04, 5mM NaF, 0.5 mg/mL BSA, 0.1%Triton X-100)
復性緩沖液(25mM Tris, pH 7.5, 1mM DTT, 0.1mM Na3VO4, 5 mM NaF)
200nM的ATP，50uCi r-P32-ATP
主要設備
高速離心機，研缽，蛋白電泳槽，電泳儀，Phosphorlmager
實驗材料
植物葉片
實驗步驟
1. ?挑選約5-6周大且生長狀態良好的植物葉片，按照原生質體分離方法(http: //www. genetics. mgh. harvard. ?edu_ sheenweb)分離原生質體。分別轉化各實驗中對應的質粒后室溫孵育6小時，再加入1uM ?f1g22或者水處理10分鐘后提取蛋白，進行in-gel kinase assay。在植物中，將10uM flg22或者水，再加上0.02% ?Silwet L-77后均勻的噴灑在植物葉片上，10分鐘后取下葉片提蛋白，進行in-gel kinase assay。
2. 蛋白提取
? ?1) 取6-8片葉片，液氮速凍后研磨成粉末。
? ?2) 加入蛋白提取緩沖液繼續研磨直至均勻。
? ?3) 14000rpm于4℃離心10分鐘，取上清。
3. 激酶活性分析
? ?1) 在分離膠中摻入0.25 mg/mL myelin basic protein(MBP)作為激酶底物，配制成10%的SDS-PAGE膠，取10ug蛋白電泳。
? ?2) 電泳結束后取下蛋白膠，用漂洗緩沖液于室溫洗三次，每次30分鐘。
? ?3)將蛋白膠置于復性緩沖液中于4℃過夜，中間換3次緩沖液。
? ?4) 將復性后的蛋白膠置于反應緩沖液中，再加入終濃度為200nM的ATP以及50uCi r-P32-ATP，反應60分鐘。
? ?5) 用終止緩沖液漂洗蛋白膠6次，每次60分鐘。
? ?6) 取出蛋白膠干膠后儲存于Phosphorlmager。
? ?7) 24小時后放射自顯影。
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