熒光法測定果蔬及飲料中的抗壞血酸
新編實驗
熒光法測定果蔬及飲料中的抗壞血酸
實驗目的
掌握分子熒光分析法的基本原理；了解Rf530熒光儀的使用方法；熟悉熒光法測定果蔬及飲料中的抗壞血酸含量的方法。
實驗原理
維生素C 又名抗壞血酸，自然界存在的有L型、D型兩種，D型的生物活性僅為L型的1/10。維生素C 廣泛存在于植物組織中，新鮮的水果、蔬菜中含量都很豐富。維生素C 具有較強的還原性，對光敏感，氧化后的產物稱為脫氫抗壞血酸，仍然具有生理活性，進一步水解則生成2,3-二酮古樂糖酸，失去生理作用。食品分析中的所謂總抗壞血酸是指抗壞血酸和脫氫抗壞血酸二者的總量，不包括二酮古樂糖酸和進一步的氧化產物。
測定維生素C 的常用方法有靛酚滴定法、苯肼比色法、熒光法和高效液相色譜法等。靛酚滴定法測定的是還原型抗壞血酸，該法簡便，也較靈敏，但特異性差，樣品中的其它還原性物質（如Fe2+、Sn2+、Cu+等）會干擾測定，測定結果往往偏高。苯肼比色法和熒光比色法測得的都是抗壞血酸和脫氫抗壞血酸的總量，其中以熒光法受干擾的影響較小，準確度較高。高效液相色譜法可以同時測得抗壞血酸和脫氫抗壞血酸的含量，選擇性好、準確度高、重現性好，但對樣品前處理要求高。
本實驗采用的是熒光分析法，其原理是通過將樣品中還原型抗壞血酸經銅離子催化被氧化生成脫氫型抗壞血酸后，與鄰苯二胺（OPDA）反應生成具有熒光的喹唔啉，依據熒光強度與脫氫抗壞血酸的濃度在一定條件下成正比，測定食物中抗壞血酸的總量。
試劑及儀器
Rf530熒光分光光度計，硫酸銅溶液（2.0 mg/ml），鄰苯二胺（0.3 mg/ml），抗壞血酸標準溶液（25.0 mg/L），乙酸-乙酸鈉-硫酸緩沖液（pH 5.6）。
實驗內容
（1）樣品處理
稱取一定質量的果蔬（25g左右），加入一定質量的蒸餾水（25g左右），打成勻漿后過濾，取5.0 ml濾液至50 ml容量瓶中，定容，放入冰箱內保存備用。
液體樣品不需要處理，或稀釋一定倍數后備用。 ?
（2）標準溶液及樣品溶液的配制
標準溶液的配制：取6個10 ml 比色管（編號1-6），分別加入0.0、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 ml 抗壞血酸標準溶液，再依次分別加入2.0 ml 緩沖液，0.40 ml 硫酸銅溶液和2.0 ml OPDA溶液，定容至10 ml。20 min后可進行熒光測定。
樣品溶液的配制：取1個10 ml 比色管（編號71），加入1.0 ml待測樣品溶液，再依次加入2.0 ml 緩沖液，0.40 ml 硫酸銅溶液和2.0 ml OPDA溶液，定容至10 ml。20 min后可進行熒光測定。
（3）熒光激發和發射光譜測定
取6號溶液于熒光比色皿中，在熒光儀上分別掃描其熒光激發光譜及發射光譜：首先以351?nm為激發波長，掃描發射光譜，確定最大發射波長；然后以選定的最大發射波長掃描激發光譜，確定最大激發光波長；最后再以選定的激發波長掃描發射光譜。記錄最大激發和發射波長。
（4）標樣及樣品檢測
以選定的最大激發和發射波長，依次測定1-6號標樣的熒光強度；在相同條件下，測定的7號樣品的熒光強度。
結果處理
標準曲線的繪制：根據1-6號標樣的熒光強度，以熒光強度對濃度作圖，得到標準曲線。
根據7號樣品的熒光強度，在標準曲線上讀出樣品溶液中抗壞血酸的含量；再根據樣品處理及溶液配制過程中的稀釋關系計算原始樣品中抗壞血酸的含量。
注意事項
（1）本實驗全部過程應盡量避光。
（2）鄰苯二胺溶液在空氣中顏色會逐漸變深，影響熒光衍生反應，故應用棕色瓶配制，在冰箱中保存不超過3天。
（3）不同的樣品中抗壞血酸的含量不相同，稱取的樣品量可酌量增減。
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