霍亂弧菌核酸檢測試劑盒使用說明
霍亂弧菌核酸檢測試劑盒（一管式PCR-熒光探針法）
◆ 產(chǎn)品說明
致病菌檢測系列可針對(duì)食品、飼料等樣品中的致病微生物的特異核酸片段進(jìn)行擴(kuò)增，儀器實(shí)時(shí)監(jiān)測擴(kuò)增過程中的熒光信號(hào)變化，自動(dòng)判讀結(jié)果。本產(chǎn)品用于霍亂弧菌的檢測。檢出限為103?CFU/ml。
◆?產(chǎn)品組成（96測試）
011082LⅡ | |
試劑 | 含量 |
A-VC-P | 20μL × 8管× 12排 |
NG-P | 100μl× 3支 |
PG-VC-P | 100μl× 2支 |
◆?適用儀器
ABI 7500、CFX 96、Mx 3005P、LineGene9600等實(shí)時(shí)熒光PCR儀。
◆?自備耗材和儀器
①冰盒；②移液器（0.5-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套滅菌吸頭；③離心機(jī)；④渦旋混勻器；⑤金屬浴；⑥均質(zhì)機(jī)、攪拌機(jī)或研缽等研磨器具；⑦電子天平。
◆?注意事項(xiàng)
1．本試劑檢測靈敏度高。為了防止污染，實(shí)驗(yàn)要分區(qū)操作。
1）第一區(qū)：樣本制備區(qū)。
2）第二區(qū)：模板添加區(qū)。
3）第三區(qū)：擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)。
分區(qū)之間最好進(jìn)行物理性隔離，避免人為因素造成的污染。
2．實(shí)驗(yàn)過程中穿戴工作服和乳膠手套，不同區(qū)域獨(dú)立使用工具，需更換手套和實(shí)驗(yàn)服。
3．嚴(yán)格按照操作步驟操作，試劑配制和加樣等步驟請(qǐng)嚴(yán)格按照說明書要求在冰盒上操作。
4．反應(yīng)液中的成分對(duì)光敏感，應(yīng)避光保存。試劑使用前要完全解凍，但應(yīng)避免反復(fù)凍融，推薦使用前離心30秒，并按檢測頻次將反應(yīng)液以適當(dāng)體積分管保存。
5．反應(yīng)結(jié)束后，擴(kuò)增管請(qǐng)置于密封袋內(nèi)丟棄，當(dāng)日清理，開蓋易造成氣溶膠污染，禁止開蓋。
6．不同批號(hào)試劑請(qǐng)勿混合使用，在有效期內(nèi)使用。
◆?樣品處理
參照《SN/T 1022-2010 進(jìn)出口食品中霍亂弧菌檢驗(yàn)方法》中的7.1和7.2處理樣品，對(duì)樣品進(jìn)行前增菌，制備的菌液保存待用。
以無菌操作取檢樣25 g，放入裝有225 mL滅菌APW增菌液的均質(zhì)杯內(nèi)，于8000rpm/min～10000rpm/min均質(zhì)1 min～2 min，或以剪刀充分剪碎，制成1:10樣本勻液。深凍樣品、干品、鹽漬產(chǎn)品的初始增菌液放置在37℃ ± 1℃培養(yǎng)6 h ± 1 h，新鮮樣品的初始增菌液放置在41.5 ℃ ± 1 ℃培養(yǎng)6 h ± 1 h。如果樣品不夠25g，則取全部樣品，加入9xmL增菌液以獲得10-1濃度的樣品勻液。若上述制備的待檢樣品不能在當(dāng)日進(jìn)行培養(yǎng)，應(yīng)放置在2℃~8℃保存至次日。為提高檢出率，可進(jìn)行第二次增菌，取1 ml培養(yǎng)物接種到10 ml的APW中，置于41.5 ℃ ± 1 ℃培養(yǎng)18 h ± 1 h（加入樣品前，APW應(yīng)預(yù)先保溫至37℃±1℃）。
詳細(xì)步驟請(qǐng)按照標(biāo)準(zhǔn)操作或查閱食安通軟件。
◆?實(shí)驗(yàn)操作
1. 模板制備（樣本制備區(qū)）
建議使用試劑配套細(xì)菌組DNA提取系列產(chǎn)品，具體過程詳見產(chǎn)品說明書。
2．添加模板（樣本制備區(qū)，放置于冰盒中進(jìn)行）
剪下所需測試數(shù)的已含有反應(yīng)液的PCR管，放置在室溫待解凍后，離心30秒后揭開封口膜，向每管反應(yīng)液中分別加入5μL模板，順序?yàn)镹G、待測樣品模板、PG-VC-P。蓋好配套的PCR管蓋后，渦旋混勻30s，離心1min，立即進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。
3. 擴(kuò)增反應(yīng)（擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)）
使用熒光定量PCR儀，熒光基團(tuán)選擇FAM，淬滅基團(tuán)選擇TAMRA。
按下列條件設(shè)置擴(kuò)增反應(yīng)：
PCR循環(huán) | 熒光收集位點(diǎn) | ||
95℃ | 3分鐘 | 1個(gè)循環(huán) | — |
94℃ | 5秒 | 40個(gè)循環(huán) | — |
60℃ | 40秒 | ※ |
4.基線和閾值設(shè)定
基線調(diào)整取3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)，閾值線應(yīng)超過陰性對(duì)照擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)。
◆?結(jié)果判定
檢測樣品無Ct值或≥40.0，曲線為直線或輕微斜線，無“S”型擴(kuò)增曲線，可報(bào)告樣品陰性，不含有霍亂弧菌或含量低于檢測限；
檢測樣品Ct≤35.0，曲線呈“S”型擴(kuò)增曲線，可直接報(bào)告樣品陽性，含有霍亂弧菌；
檢測樣品35.0＜Ct＜40.0，需進(jìn)行一次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，若Ct值≥40.0則為陰性，否則為陽性。
NG反應(yīng)為平滑直線，PG反應(yīng)為“S”型擴(kuò)增曲線且Ct值＜30，此次檢測結(jié)果有效，否則無效。如重復(fù)檢測結(jié)果仍為無效，請(qǐng)與技術(shù)支持人員聯(lián)系。
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焦點(diǎn)事件
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