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光譜流式細胞術如何改變熒光染料在高維研究中的開發前景
我們對細胞有了前所未有的深入了解。隨著對細胞生物學和細胞分子特征的了解日益加深，我們對開發一種工具以詢問并探究細胞之間復雜關系的需要也更甚。流式細胞術是一種強大的免疫表型分析技術，可分析不同的細胞群。近年來，熒光染料開發技術的進步使得可用于流式細胞術的熒光染料數量呈指數級增長。與此同時，儀器功能也隨之增加，如增加了激光器和檢測器數量，以及可測量參數的數量。但隨著儀器復雜性和可用熒光染料的增加，也帶來了更多與流式細胞術多色實驗方案設計相關的挑戰。這種復雜性意味著研究人員需仔細研究每個熒光團的濾光片所定義的光譜范圍，以此設計多色實驗方案，同時需選擇正確的熒光團以避免熒光溢出和擴散。因此，熒光染料的開發很大程度上受限于濾光片所收集的發射光譜范圍。
光譜流式細胞術通過探索熒光染料的完整發射模式，消除了這一障礙。光譜流式細胞術的出現為開發大量新染料以擴展多色實驗方案提供了更多可能性。在此，我們考慮了傳統流式細胞術和光譜流式細胞術的差異，并展示光譜流式細胞術如何改變熒光染料的開發前景。
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傳統流式細胞術與光譜流式細胞術：主要區別是什么？
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熒光染料與檢測器之間的關系
兩種流式細胞術的主要區別在于流式細胞儀中檢測器的光譜覆蓋范圍。在傳統流式細胞儀中，熒光染料的發射光譜由單個檢測器采集。但檢測器僅覆蓋一部分熒光染料發射光譜，其覆蓋范圍由單個濾光片界定。具有適當帶寬的濾光片可檢測熒光染料的發射峰，并避開激光線、重疊區域以及沒有可用熒光蛋白的區域。因此，在傳統流式細胞術中，熒光染料和檢測器之間存在1對1的關系。為覆蓋整個可見光譜，需在傳統流式細胞儀中添加額外的檢測器。
在光譜流式細胞儀中，熒光染料的整個發射光譜由多個檢測器或檢測陣列采集。對于每個激光器，發射光通過棱鏡、濾光片或光柵均勻分割，并被引導至整個光譜的各個檢測器中。在這種情況下，熒光染料與檢測器存在1對多的關系。因此，一般而言，光譜流式細胞儀中的檢測器數量多于傳統流式細胞儀，盡管一些復雜的傳統流式細胞儀（如BD FACSymphony? A5細胞分析儀和BD FACSymphony? A3細胞分析儀?）與某些光譜流式細胞儀的熒光檢測器數量相同。通過光譜流式細胞儀能夠采集更多數據點，從而實現更精細顆粒的信號分離，以提高熒光染料之間的分辨率。
補償和光譜解析
在傳統流式細胞儀中，單個熒光染料的部分發射光譜由單個檢測器采集。但是單個熒光染料可被多個激光激發；因此在一個檢測器中測量的總熒光數量可能來自多個熒光染料。在傳統流式細胞儀中，補償過程用于從重疊光譜中減去背景信號。
光譜流式細胞儀測量光譜中熒光染料的完整發射模式。光譜解析算法能夠區分單個熒光染料的光譜圖。與傳統流式細胞儀相比，這種解析高度重疊熒光染料（如FITC和BD Horizon Brilliant? Blue 515 [BB515]）的單個光譜特征的能力增加了可在光譜流式細胞儀中同時使用的熒光染料數量。這也使得與傳統流式細胞儀相比，光譜流式細胞儀能夠設計更大、更復雜的多色實驗方案。?
開發具有不同光譜特征的新熒光染料 ?
光譜流式細胞術能夠檢查整個光譜，這使得開發具有不同光譜特征的新染料成為可能，從而用于高參數分析以獲得更高分辨率和更精細顆粒度。新染料技術的開發使BD生物科學不斷推陳出新。
新推出的BD Horizon RealYellow? 586（RY586）熒光染料是BD Horizon RealYellow? 和RealBlue? 試劑系列中的首款染料，其利用下一代BD染料技術和AI引導的熒光染料選擇來優化光譜定位，從而在與其他熒光染料聯用時減少溢出，并提供最佳分辨率。這使其能夠在光譜流式細胞儀上與具有高交叉激光激發的染料[如藻紅蛋白（PE）]一同使用。
PE熒光染料由藍激光和黃/綠激光激發，其發射光譜圖在紫外、紫色、藍色和黃綠色檢測器上顯示明顯的發射峰。然而，RY586熒光染料由藍激光和黃/綠激光激發的交叉激光激發最小，并且在黃綠色波長處顯示明顯的發射峰，而進入藍色、紫色和紫外檢測器的發射較少。
RY586表現出的藍激光、紫激光和紫外激光交叉激發明顯較少，從而導致溢出減少。該圖比較了PE和RY586的標準化發射光譜圖，顯示進入藍色、紫色和紫外檢測器中的RY586發射較少。
對于傳統工作流（檢測器和熒光染料之間存在1對1的關系），當在多色實驗方案中使用這兩種熒光染料時，PE和RY586因重疊太高而無法解析。因此，傳統流式細胞儀中只能使用其中一種熒光染料。
然而，光譜流式細胞儀則可輕松檢測并解析PE和RY586之間的差異，因此可同時使用這兩種熒光染料。由于在光譜流式細胞儀上可同時使用RY586和PE，可測量的參數數量增加。這一點十分重要，特別是在高參數分析中，再添加一個標記物將使結果的顆粒度更精細，并有助于獲取更深入的科學見解。
通過利用熒光染料的整個發射光譜的能力，光譜流式細胞儀正迅速改變熒光染料的開發前景，為更多創新方法奠定基礎，并進一步擴展流式細胞儀的能力！
