神經分析方案革新:無標記自動化高通量活細胞神經生長動力學評價
體外神經突生長分析是神經科學研究領域非常重要的實驗方法,主要用于評估神經元的結構和功能,在神經相關疾病研究、模型建立和藥物評價領域應用廣泛。現有的評價方案多基于特定的神經細胞熒光標記,抑或由于設備限制,無法開展神經細胞生命周期的全時程監測。
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安捷倫 BioTek 近期推出了全新神經細胞分析軟件模塊,搭載經典的 Cytation&BioSpa8 高通量活細胞成像平臺,可輕松幫助研究者獲得?Label Free?的神經突生長動力學分析結果。
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Cytation 成像平臺的?Label Free?技術優勢
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無標記成像技術提供了一種在活細胞中評估神經生長的最精簡操作方案,相較之下,由于必須證明熒光標記物不會干擾研究中的生物過程,用于活細胞分析的熒光模型需要大量的開發和驗證投入。相反,無標記方法能夠立即適用于各種樣本類型,包括那些不適宜進行熒光操作的樣本。此外,使用無標記方法也可以很好的避免熒光成像可能造成的細胞毒性和光毒性效應。
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安捷倫 Cytation5&7 成像平臺具有獨特設計的無標記成像硬件模塊,能夠提供三種不同的無標記成像模式:無標記明場、無標記高對比度明場及無標記相差成像。三種成像模式為不同的樣本類型提供高質量的無標記細胞圖像。本文中展示了明場及相差模式獲得神經細胞的無標記圖像,搭載 BioSpa8 智能培養箱,可自動化開展多通量的活細胞無標記圖像采集。
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圖 1:Cytation 成像系統的三種不同的無標記成像模式
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主要實驗流程
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本文采用 iPSCs 誘導的皮質神經元(iCell GlutaNeurons)模型,細胞接種于 96 孔板后,設置總長度為 5 天的 BioSpa8 培養流程,其中前24小時細胞貼壁生長,隨后進行第一次 50% 培養基換液及給藥,培養至 48 小時完成第二次培養基換液及給藥。最后通過 BioSpa8 程序自動完成后續的神經生長調節劑評價檢測。實驗流圖示意圖如下:
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圖 2:無標記自動化高通量活細胞神經生長評價實驗流程
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無標記神經細胞基礎生長動態評價結果
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在藥物評價之前,先對神經細胞的基礎生長進行準確評估。
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在這個實驗方案中,初次拍攝采用 3h 拍照間隔,連續采集 120 小時,采用 Gen5 軟件識別神經細胞的總長度用于評價神經細胞生長情況。比較有趣的是,結果發現起始拍照點和三小時后的第二個時間點的神經生長有較大的跳躍(圖3C,D),為了探究這個現象,前 6 個小時采用更為密集的拍攝間隔(10min),用于獲得精準的神經細胞生長曲線。結果顯示,在培養的前三個小時內,iCell GlutaNeurons 表現出快速和持續的生長增加。對培養前 3 小時神經突平均生長長度進行 Gen5 分析,結果顯示每個細胞的生長速率為~ 500 μm/天(圖 3F)。在早期快速生長期之后,神經元過渡到慢速生長階段(15 μm/天,圖 3D)。
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圖 3:無標記神經元基礎生長分析。A,20x 相差成像及軟件識別;B,20X 明場成像及軟件識別。C,相差及明場神經突總長度動力學分析數據。D,24 小時 - 120 小時神經突平均長度線性擬合用于分析平均生長速度。E,拍攝間隔 10 分鐘,總拍攝長度 6 小時的神經突生長曲線。F,對前 3 小時的神經突平均長度進行線性擬合用于分析神經元生長速率。
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無標記神經突分析用于評價藥物作用效果
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神經元生長曲線分析結果可用于幫助選擇給藥時間點,本方案中選擇神經細胞種板后的 24-48 小時完成給藥,在 96 孔板上評價了 4 種不同的神經生長調節劑的作用效果,包括 Blebbistatin(布比他汀)、6BIO(公藤甲素)、triptolide(雷公藤內酯)和 Staurosporine(星形孢菌素),每種藥物設置 3 個濃度梯度。本分析方案中,能夠獲得每種藥物對神經元突起總長度(圖 4)、平均突起長度和神經突數量的定量結果(圖 5),并且 Gen5 的動力學曲線分析能夠獲得每種藥物的促神經生長時間窗口、高濃度細胞抑制時間窗口、平均治療后反應時間等參數(圖 5)。
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圖 4:四種不同的神經調節劑對 iCell GlutaNeurons 的生長作用效果的動態評價。評價指標:神經突總長度,成像模式:20X相差。A:Staurosporine(星形孢菌素)B:Blebbistatin(布比他汀)C:6BIO(公藤甲素)D:triptolide(雷公藤內酯)。
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圖 5:平均神經突長度和單細胞神經突分支數動力學分析結果用于確定每種藥物的治療反應時間。
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最后,通過在 Gen5 軟件中計算動力學成像過程最后 12 小時的神經分析參數的平均值,可以獲得每種藥物的劑量 - 反應曲線(圖 6),以下結果展示了總神經突長度、平均神經突長度、單細胞神經突分支數三種不同評價指標獲得的藥物劑量效應曲線。
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圖 6:無標記神經突生長分析的劑量反應評估。A:總神經突長度;B:平均神經突長度;C:平均神經突計數。
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方案優勢小結
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本方案中,采用 Cytation5&BioSpa8 平臺能夠為廣大神經領域的用戶提供自動化便捷的長時程無標記神經生長方案,通過 Gen5 的曲線分析獲得豐富的神經生長動力學參數,其中值得推薦的功能包括:
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神經細胞生長拍攝間隔靈活,支持數秒至數天的間隔時間調整,適合于不同的研究目的,并且支持可變間隔動力學程序設置;
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神經細胞成像模式多樣,一個程序內兼容明場和相差及熒光場成像;
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無標記樣本神經突識別準確,提供多種神經突分析參數;
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生長動力學參數豐富:平均生長速率、藥物促神經生長時間窗口、高濃度細胞抑制時間窗口、平均治療后反應時間等;
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