轉(zhuǎn)膜是把DNA 從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)移到固相支持物（一般是尼龍膜）上固定，是進行各種后續(xù)研究（如 RFLP 分析，陽性克隆的篩選驗證等所有涉及分子雜交的研究）的前提。

　　實驗?zāi)康模?/p>

　　掌握 Southern blotting 的原理及操作步驟

　　實驗原理：

　　1．轉(zhuǎn)膜的方式：

　　 向上的毛細(xì)管轉(zhuǎn)移

　　 向下的毛細(xì)管轉(zhuǎn)移

　　 同時向兩張膜轉(zhuǎn)移

　　 電轉(zhuǎn)移

　　 真空轉(zhuǎn)移

　　2．固相支持物的種類及選擇：

　　硝酸纖維素膜：非共價結(jié)合，易脆，易丟失DNA ， < 500 bp 的DNA 無效，轉(zhuǎn)膜前的工作（從提高轉(zhuǎn)膜效率，利于轉(zhuǎn)膜后使用等）。

　　尼龍膜（帶正電荷的）高強度，不易破損，具有較大的DNA 結(jié)合容量，它能夠吸附變性DNA ，核酸以共價結(jié)合方式不可逆的結(jié)合在尼龍膜上。尼龍膜兩邊均有吸附DNA 的功能，無論用哪邊均可以經(jīng)久耐用，可反復(fù)利用 10 次以上（ 10-20 次），經(jīng)毛細(xì)管（毛細(xì)吸附）作用，把DNA 從凝膠上轉(zhuǎn)到膜上。DNA 轉(zhuǎn)到膜上是復(fù)制膠上的帶型，在 80-100 ℃真空干燥 2-4 hrs ，即可固定DNA 。

　　3．轉(zhuǎn)移緩沖液（ transfer buffer ）的選擇：

　　帶正電荷的尼龍膜：可用高鹽離子強度（ SSC ），但不能充分發(fā)揮膜潛能； 0.4N NaOH ，共價結(jié)合DNA 是最大優(yōu)點。

　　硝酸纖維膜：高鹽離子強度促進DNA 與膜結(jié)合（ 20 × SSC ），低鹽離子強度導(dǎo)致小片段DNA 在轉(zhuǎn)移過程中丟失， pH>9 ，DNA 不能與膜結(jié)合。

　　4．轉(zhuǎn)膜時間（ duration of transfer ）約 12 hrs。

　　 取決于毛細(xì)管系統(tǒng)，DNA 大小，膠厚度 (<5 mm) 及濃度 (<1%) 。

　　 DNA 分子量大小決定時間長短，部分去嘌呤減小DNA ，堿轉(zhuǎn)移 2hrs 大部分結(jié)合到膜。

　　 DNA 轉(zhuǎn)移的效率較難判斷，只有在轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，通過 EB 染膠，及分子雜交才可以鑒別效率高低，但已無補救措施，因此，每一步應(yīng)嚴(yán)格操作。

　　實驗材料及試劑： 酶消化好的DNA 樣品，尼龍膜， 0.2NHCl ， 0.4N NaOH 等。

　　實驗步驟：

　　1．0.8% 瓊脂糖電泳。

　　 制膠：注意瓊脂糖的質(zhì)量，膠的濃度，厚度（<5mm）及均一性。一般大電泳槽配制 250ml 0.8% 瓊脂糖凝膠，采用 42 孔梳子（經(jīng)濟，高效）。

　　 制樣，點樣：DNA 樣品中指示劑量稍多。

　　 電泳：一般 1-1.5V/cm 的電壓，使DNA 遷移到適當(dāng)距離，一般指示劑約移動 10-11cm ( 大電泳槽： 40V × 12-15hrs ，小電泳槽 30V × 4-5 hrs)。

　　2．轉(zhuǎn)膜前的準(zhǔn)備：

　　 依膠大小每塊凝膠準(zhǔn)備兩張比膠稍大的濾紙（ 11 × 12.5 cm ），兩張用作鹽橋的濾紙，一張與膠同樣大小的尼龍膜（ 10 × 10.5cm ），兩個玻璃盤、兩塊有機玻璃板、一根玻璃棒，比尼龍膜稍大的一疊吸水紙等。

　　3．一玻璃盤中加入足量的 0.4N NaOH ，放上洗凈的玻璃板，按圖示搭制鹽橋 ( 操作示范 ) 。

　　4．凝膠的預(yù)處理：

　　a.從電泳槽中移出凝膠置于塑料板上，用切膠板把膠切成適當(dāng)大小，切去右上角（最后一個樣品的最前端）作為電泳方向記號。

　　b.把凝膠翻面，放入加有足量 0.2N HCl 的玻璃盤中，輕輕搖動 10min ，使指示劑變黃色為止（脫嘌呤）。

　　c.倒去 HCl 溶液，加蒸餾水漂洗凝膠。

　　d.倒去蒸餾水，加 0.4N NaOH 中和。

　　e.同時在鹽橋濾紙上灑些 0.4 NaOH ，立即將膠放在鹽橋上（忌氣泡）。

　　5．膠的四周用塑料片與膠緊緊相連，防止短路（吸水紙與鹽橋相接）。

　　6．在膠面上倒足夠量 0.4N NaOH ，小心放置膜（預(yù)濕 0.4N NaOH ）使膜覆蓋整塊膠（要求一次成功，不能移動）。

　　7．膜上放 2 張濾紙，濾紙大小為 15 × 12cm。

　　8．放不少于 5cm 厚的吸水紙，放上玻板，其上壓約 500g 的重物，轉(zhuǎn)膜 12 hrs 左右。

　　9．轉(zhuǎn)膜完畢，用 2 × SSC 漂洗膜兩次，各 5min 。用 EB 染膠以檢測轉(zhuǎn)移效果。

　　10．用兩張濾紙包住膜，置于 80-100 ℃的真空干燥箱中，干燥 2-4 hrs 。

　　思考：

　?。?）為什么轉(zhuǎn)膜前要對凝膠預(yù)處理？如何處理？

　?。?）怎樣提高轉(zhuǎn)移效率？