用于檢測重組DNA，也可分析DNA樣品中是否有與探針序列同源的DNA片段。用于基因診斷，也可驗證檢測片段的分子量大小。將基因組DNA經限制性內切酶酶切，進行瓊脂糖電泳，把分離后定位在凝膠上的不同分子量的DNA經堿變性處理，將凝膠中變性的DNA轉移至一固相支持濾膜。利用標記的某一DNA、RNA或寡核苷酸與固著于濾膜上的DNA發生同源性雜交，利用放射自顯影（化學發光法或顯色法）檢測。

（一）器材：臺式離心機，恒溫水浴鍋，電泳儀，水平電泳槽，雜交爐，雜交袋，尼龍膜或硝酸纖維素膜，轉印跡裝置，濾紙，吸水紙，紫外交聯儀或80℃烤箱，搖床，X線膠片。

（二）試劑：限制性內切酶，DNA加樣緩沖液，DNALadderMarker，0.25MHCl，變性液（0.5MNaOH，1.5MNaCl），中和液（0.5MTris-HClPH7.5，3MNaCl）,轉印跡液20╳SSC（3MNaCl，0.3M檸檬酸鈉，PH7.0），標記探針，2╳SSC，預雜交液和雜交液，2×洗液（2×SSC,0.1%SDS）,0.5×洗液(0.5×SSC,0.1%SDS),1×緩沖洗液（0.1M馬來酸，0.15MNaCl,PH7.5,0.3%Tween20）,1×封阻液[1％(W/V)封阻劑溶于1×馬來酸溶液（0.1M馬來酸，0.15MNaCl,PH7.5）]，1×檢測液（0.1MTris-HCl,0.1MNaCl,PH7.5），抗－地高辛－堿性磷酸酶。

注意：若基因組DNA過低，要以較大體積進行限制酶消化，消化完畢后，可以通過乙醇沉淀、濃縮DNA片段，加少量DNA加樣緩沖液點樣。

2、消化好的樣品點樣于0.7％瓊脂糖凝膠進行電泳；

注意：為保證DNA均勻分散于加樣孔，應緩慢將樣品加至加樣孔。

3、電泳結束后，將凝膠依次用如下試劑處理進行堿變性，室溫下輕輕搖動確保溶液覆蓋凝膠0.25MHCl10－15min

蒸餾水搖洗5min

變性液40min

蒸餾水搖洗5min

中和液15min，2次；

4、在凝膠堿變性的同時，制備轉印跡裝置。

Southernblot轉膜技術有三種：

1），毛細管轉移法；

2），電轉移法；

3），真空轉移法。這里介紹最經典的毛細管轉移法（向上轉移），在轉印跡槽中，倒入20╳SSC溶液，槽中置一固相支持物，在固相支持物上從下向上依次置入：兩張與凝膠等寬的濾紙，將濾紙縱向自固相支持物垂于轉印跡槽中（簡稱“橋”），底面在上的凝膠，濾膜（與凝膠等大），濾紙（與凝膠等大），吸水紙（略小于濾紙，5－8cm高），400－800g重物。凝膠四周用Parafilm膜包圍防止短路。濾膜事先用2╳SSC浸濕至少5min。濾紙事先用20╳SSC浸濕。轉膜4－18小時；

注意：轉膜裝置中各層濾紙和膜之間要將氣泡趕凈。一旦建立轉膜系統后，要防止濾膜和凝膠錯位。防止吸水紙倒塌和完全濕透，要及時更換吸水紙。

5、轉膜結束后，取出濾膜，邊角剪一小角做標記。濾膜于2╳SSC搖洗5min，用濾紙吸干；

6、用紫外交聯照射（正面朝上）或于80℃烤箱烘烤0.5－2小時；

7、膜可立即進行預雜交和雜交，或保存于4℃待以后應用；

8、預雜交和雜交

1）將雜交膜浸濕于6╳SSC2min，同時預熱預雜交液和雜交爐至預雜交溫度；

2）雜交膜封于雜交袋，按0.2ml/cm2膜面積加入預雜交液，預雜交至少1小時；

3）用于southernblot的探針可分為DNA探針、RNA探針和寡核苷酸探針。對探針的標記方法又可以分為放射性標記和非放射性標記。這里主要介紹非放射性地高辛標記探針的雜交方法。雜交時各種探針的用量：DNA探針，5－25ng/ml；RNA探針，100ng/ml；寡核苷酸探針，0.1－10pmol/ml。雙鏈DNA探針提前100℃變性10min后迅速冰浴，單鏈探針無需變性。將處理后的探針加入雜交液溫浴至雜交溫度。雜交溫度的選擇根據雜交液的不同而不同；

注意：應用寡核苷酸探針時，雜交溫度的選擇。Tm＝4╳(GC)2╳(AT),雜交溫度比Tm低約10℃。

4）棄去預雜交液，將含探針的雜交液注入雜交袋，至少3.5ml/10╳1℃m，置入雜交爐滾動；

9、雜交后的洗膜處理過程，順序如下：

2×洗液2×15min

0.5×洗液2×15min

1×緩沖洗液1×3min

1×封阻液1×60min

抗體液*1×30min

1×緩沖洗液2×15min

1×檢測液1×5min

*抗－地高辛－堿性磷酸酶用1×封阻液稀釋10，000倍（若用顯色法稀釋5000倍；若用CDP-Star檢測用20，000倍稀釋）；

10、將膜浸于CSPD液（CSPD用1×檢測液稀釋100倍，CDP-Star也用1×檢測液稀釋100倍）室溫避光靜置5min；回收剩余的CSPD液或CDP-Star液避光保存于4℃可反復應用3－5次；

11、將膜上殘液吸凈，用保鮮膜封好于37℃反應15min，然后將膜固定于壓片夾，進行曝光。

注意：若用顯色劑檢測，新鮮配置顯色劑（45μlNBT和35μlBCIP溶于10ml1×檢測液），將膜浸于顯色劑中避光反應4－16小時，反應期間不要移動膜。