陽性克隆篩選方法匯總

　　——基于ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9基因敲除方法

　　近幾年來，基因重組的技術層出不窮，包括TALEN和CRISPR/Cas9在內的重組技術給基礎研究提供更為方便和快捷的分子生物學工具。

　　關于這些技術的具體原理和操作細節，這里不做展開介紹，主要談一談在用這些技術進行細胞株構建的過程中，如何做才能加快陽性克隆篩選的步伐,做好這個關鍵的步。

　　一，混合克隆pool驗證

　　質粒轉染后48-72小時后取轉染后細胞的pool 1000個細胞以上離心，去上清，PBS洗一遍，細胞沉淀溶于適量的PBS中，煮5min后模板就制備好了，剩余的pool細胞做有限稀釋，一般5塊板足夠。

　　分析敲除位點的上下游序列，設計合適的引物PCR擴增目的基因片段，與野生型目的基因雜交后CruiserTM酶切15-20分鐘，酶切產物1.5%-2%凝膠電泳。

　　上圖為混合克隆pool酶切檢測，由此圖可知此混合克隆pool中有敲除成功的細胞，則進行下一步并計算突變率。這一步尤為重要，很多雜志投稿時需要這張圖，或者有計算突變率的要求。

　　二，陽性克隆篩選

　　上一步采用有限稀釋法接種到96孔板中的克隆，待到單個細胞長到幾百到1000個細胞左右時，取出其中的一半細胞提取基因組。分析敲除位點的上下游序列，設計合適的引物，并從提取的基因組中擴出目的片段，然后選擇CruiserTM或者T7E I進行酶切分析，最后將酶切分析得到的陽性克隆再進行測序進行最終確認。

　　此圖為兩個陽性克隆的酶切結果，先酶切再測序不僅可以避免單一方法出現的假陰性，而且可以滿足大部分雜志會要求，以免被要求補數據。

　　為了可以很快的篩選到陽性克隆可以通過如下幾個方式去進行優化：

　　1、盡可能提高單細胞的存活率。

　　a)對于單個細胞很難存活的細胞，如果是貼壁細胞，可以試著加一些細胞因子促進細胞的分裂；而對于懸浮細胞，則推薦采用Cell Plaza（共培養的原理），都可以極大的提高細胞的存活率；

　　b)對于很容易老化的細胞，推薦對細胞進行永生化改造，永生化的方法有很多，這里不做具體推薦。

　　2、采用能夠快速抽提微量樣品基因組DNA的試劑盒。

　　這樣的試劑盒，市面上也比較多，但是需要注意選擇針對樣品量比較少的試劑盒，建議選擇QIAGEN或者Genloci的微量樣品的抽提試劑盒。QIAGEN是老品牌，Genloci這家公司是主要做基因重組的，所以，他們開發的一些產品針對性比較強，而且價格便宜，建議優先使用。

　　3、設計合理的引物和選用高保真的Taq酶；

　　引物設計推薦選擇靠近靶位點上游100bp和下游200bp處，或者上游200bp和下游100bp處，這樣的好處是后面進行酶切分析的時候，對于陽性的克隆，可以很容易觀察到2條分開的條帶。

　　Taq酶，建議是用NEB的Fusion或者Q5，畢竟敲除本身很大可能也就是2-3個堿基的缺失，所以，高保證是必要的，防止產生假陽性的結果。

　　4、選擇高特異性的錯配酶；

　　目前用的比較多的是CEL I和T7E I 兩種酶，CEL I是植物來源的一種特異性識別堿基錯配的酶，活性高，不會產生假陽性。目前市面上只有CruiserTM和Surveyor和兩個品牌。其中Surveyor是進口代理產品， 價格較貴，貨期較長；CruiserTM價格合適，同時貨期短，國內可以2-3天內到貨，做到真正質優價廉。

　　T7E I是NEB的產品，最早并不是為了做基因敲除篩選用的。其最主要的特點是除了識別錯配外，還可以識別十字型結構 DNA、Holliday 結構或交叉 DNA、異源雙鏈 DNA，正是因為這個特點，很容易導致假陽性的現象。

　　圖1. Holliday交叉（Holliday junction），無錯配結構

　　5、選擇服務好的測序公司

　　測序公司往往是比較容易忽略的一個環節，很多人送測序后，拿到的測序結果經常發現沒信號，就認為是自己的樣品有問題，而不會去懷疑測序公司。實際上是錯誤的思維方式，測序是苦力活，人員流動比較大，所以經常會發現某一段時間的測序結果總是不好，實際上跟樣品無關而跟測序公司的人員流動有很大關系。所以，一定要找一些資質比較好的測序公司，同時，發現問題的時，可以考慮換一家公司再測一遍。