骨髓基質干細胞的分離與培養 骨髓基質干細胞(BMSC)是最常見的成體干細胞，其操作流程比較穩定和成熟。即以BMSC為例，初步闡述成體干細胞具體應用步驟與流程。 (一)骨髓基質干細胞分離培養的準備工作1.配制DMEM培養液取DMEM培養基10g，NaHC03 2.2g，L-谷氨酰胺300mg，維生素C 37.5mg，青霉素10萬單位，鏈霉素10萬單位，加適量三蒸水充分溶解后，調節pH值至7.4，補三蒸水至900m1。經無菌0.22btm過濾器過濾后，加FBSl00ml，4℃保存。2.配制胰蛋白酶-EDTA消化液稱取胰蛋白酶0.125g，EDTA 0.01 g，適量PBS充分溶解，調pH值至7.4，補三蒸水定容至100ml，0.22um過濾器過濾除菌，分裝，4℃保存。3.配制Percoll分離液Percoll原液與1.5mol/LNaCl以9:1比例稀釋。4.配制成骨誘導培養液DMEMlog/L，p-磷酸甘油鈉10nmo/L，地塞米松10nmol/lL-a-磷酸抗壞血酸50btmol/L，L-谷氨酰胺300mg/L，l，25(OH)2-維生素D3 10nmol/L，10％胎牛血清。5.配制成軟骨細胞誘導培養液DMEM 10g/L，地塞米松10 nmol/L，L-α-磷酸維生素C 50 umol/L，L谷氨酰胺300mg/L，TGF-βl 10ng/ml，IGFl00ug/ml，10％胎牛血清。6.配制成脂肪細胞誘導液DMEM 10g/L，10％FBS，1-甲基-3-異丁基黃嘌呤0.5mmol/m1，地塞米松1mmol/m1，胰島素10ug/m1，吲哚美辛100mmol/m1。 (二)骨髓基質干細胞的分離與培養1.人骨髓的抽取成年志愿者應無系統性疾病，年齡最好在20～40歲之間。所用器械預先用肝素潤濕，10m1注射器吸人1ml肝素化PBS(1 000U/ml)。骨髓提供者仰臥位，髂前上棘常規消毒、鋪巾，用2％利多卡因局部浸潤麻醉，骨髓穿刺針垂直進入骨髓腔中，緩慢抽取2m1骨髓，立即注入15ml離心管中(如需骨髓量多，必須重新更換穿刺點，防止外周血造成骨髓稀釋)。動物的骨髓穿刺過程基本相似。2.BMSC的分離采用密度梯度離心法。骨髓以24號注射針頭反復吹打成單細胞懸液，600g離心5min，小心吸去上層懸浮脂肪。離心管中預置Percoll分離液，Percoll原液比重1.13g/m1，用0.9％生理鹽水調整至密度1.073g/m1。注意將骨髓沿管壁緩慢滴加入Percoll液面上，兩者(骨髓：Percoll)體積為l：2；900g離心30min。可見離心管中液體分為5層，毛細吸管吸取percoll層上云霧狀有核細胞層，加入PBSloml，600g離心15rain，棄上清液獲取有核細胞，細胞計數。以lXl0’/cm2密度接種于培養皿，加入10 m1低糖DMEM培養液，37℃,叵溫，在5％C O2、95％O2混合氣體環境中培養。3.BMSC原代培養原代細胞接種后，每天倒置顯微鏡觀察細胞貼壁情況，根據細胞貼壁情況，于接種后2～5天換液。換液時先輕輕搖動培養皿，使未貼壁的紅細胞浮起，吸除含大量紅細胞的培養液，PBS洗滌2～3次。此時在低倍鏡下可清楚地見到多個克隆形成，加入新鮮培養液，繼續在相同的條件下培養。原代細胞一般于7～14天達到80％融合，傳代培養。4.BMSC消化傳代吸去培養液，加入PBS 10 m1，清洗2遍；吸盡PBS后加入0.25％胰蛋白酶-EDTA4m1，37~C放置2rain；待細胞變圓形浮起，加人含血清的培養液4m1，終止消化。收集細胞到離心管內，l 500r/min離心5min，吸去上清液；加入10mlPBS，漩渦振蕩器內混勻，臺盼藍染色觀察軟骨細胞活力，血細胞計數板計數。以4X10’/cm2接種到10cm培養皿培養，加入10ml培養液，37~C恒溫培養。5.BMSC多向誘導實驗傳代培養時分別采用以上配制的成骨、成軟骨細胞、成脂肪細胞誘導液培養，倒置顯微鏡觀察細胞形態，培養皿底部預置玻片用于檢測。對照組仍用含10％FBS的DMEM培養液培養與傳代，與誘導組同期傳代，同期觀察。