隨著代謝組學(xué)的發(fā)展，已經(jīng)有越來越多的領(lǐng)域開始在用代謝組學(xué)方法來進行研究，因此用于代謝組分析的樣本也多種多樣。本文擬從動物、植物、微生物等幾個主要方面，對這些不同樣本的制備方法做出相應(yīng)介紹，旨在為各位研究人員的實驗提供一個具體參考。

1、動物樣本的制備方法

a) 血液樣本制備

i. 采集血液樣本，通常會在采集后于室溫下放置30 min以上，等待蛋白質(zhì)的凝結(jié)或是待抗凝劑與血液混合均勻；

ii. 離心取上清（若加了抗凝劑，則此時取的是血漿；若沒有加抗凝劑，則此時取的是血清），常用的離心條件一般是4 ℃、5000 rpm，離心10 min，當(dāng)然不同實驗室在實際操作時可能會略有變動；

iii. 參考Patrizia Bernini等[1]的做法，將300 μL磷酸緩沖液（含70 mM Na2HPO4、38 mM NaN3和55 mM TMSP，用20%的D2O配制，pH = 7.4）加入300 μL的血漿/血清樣本中，然后取450 μL該混合溶液轉(zhuǎn)移到4.25 mm的核磁管中待測。實際上，緩沖液的配方和PH值多種多樣，一般會根據(jù)具體的生物樣本類型來選擇。而對于有抑菌效果的NaN3，當(dāng)樣本是現(xiàn)采現(xiàn)測時，很 多研究者也會選擇不使用添加。

b) 尿液樣本制備[2]

i. 收集尿液樣本，放在-80 ℃保存；

ii. 在做NMR分析前將尿液樣本取出解凍并在6000 rpm下離心15 min取上清；

iii. 在540 μL上清液中加入60 μL含0.1% TSP和2 mM NaN3的緩沖溶液（pH = 7.4，1.5 M KH2PO4的D2O），這一步可以有效穩(wěn)定尿液樣本的PH值，在混勻后待測。盡管此文獻中沒有特別注明，但通常建議離心過程應(yīng)在4 ℃下進行，以防止離心過程中產(chǎn)生的熱量很可能會導(dǎo)致微生物的產(chǎn)生，從而改變代謝物的組成。

c) 脊髓液樣本制備[3]

i. 收集脊髓液，首先離心去除細胞組分，然后于-80 ℃下保存；

ii. 在NMR分析前，將脊髓液拿出來解凍，使用離心超濾膜 去除3000分子量以上的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)分子；

iii. 超濾收集約585 μL體積的濾液，然后加入65 μL標準溶液 ，再加入少量NaOH或HCL調(diào)整樣本的PH值在6.8±0.1；

iv. 取600 μL該混合液到5 mm核磁管中待測。

d) 組織樣本制備

在文獻[4]中，作者對肌肉組織做了基于NMR檢測的提取條件的一些比較，發(fā)現(xiàn)提取溶劑以甲醇/氯仿/水（v/v/v, 2/2/1.8）為最佳，與組織的比例為30 mL/g。另外作者還用了三種不同方法來破碎樣本，分別是研磨并凍干的樣本粉末、研磨過的濕組織樣本和電子組織勻漿器（5 mL/g的提取溶劑比例）處理過的濕組織樣本，發(fā)現(xiàn)凍干粉樣本的譜圖基線明顯比另兩種方法處理的要更平一些，而且樣本間的差異最小，勻漿法次之。凍干粉樣 本的制備方法為：

i. 離體組織在液氮條件下速凍，并且于-80 ℃下保存；

ii. 液氮條件下研磨；

iii. 冷凍干燥得到凍干粉；

iv. 以30 mL/g的比例加入提取溶劑甲醇/氯仿/水（v/v/v, 2/2/1.8）。

v. 將樣品渦旋3次，每次15 s，中間停頓的時間應(yīng)將樣本放在碎冰上使之維持低溫態(tài)。

vi. 在4 ℃、10000 g的條件下離心10 min，去除上清液，即得代謝物的提取溶液。

由于處理得到凍干粉樣本一般都要耗費較長時間，為了兼顧較高的提取效率、良好的重現(xiàn)性以及操作的簡便和快速，因此可以考慮使用勻漿法來制備組織樣本，并使用甲醇/氯仿/水（v/v/v, 2/2/1.8）作為提取溶劑。

2、植物樣本的制備方法[5]

一般而言，植物的代謝狀況會因其生長周期、選取部位和刺激條件等不同而呈現(xiàn)出明細差異，因此在采集植物樣本時，實驗者應(yīng)盡量減少因樣本的采集差異而 引進的變量。其次，由于液氮的低溫可以防止樣本中降解反應(yīng)的發(fā)生，因此大多使用液氮速凍樣本并研磨成粉末。

另外，水分的存在可能會使植物樣本的代謝物發(fā)生 酶促反應(yīng)，又或者可能會改變樣本的PH值，從而對分析結(jié)果造成較大影響，因此通常都會對粉末樣本進行冷凍干燥。

NMR代謝組分析所需的樣本量一般在50 mg到500 mg之間，具體所需的量不僅取決于樣本本身的類型，而且還跟所選的提取溶劑有關(guān)。但一種溶劑是不可能將樣本中的所有代謝物一次性都提取出來的，因此對提取 溶劑的正確選擇對代謝物的提取至關(guān)重要。

代謝物有極性和非極性之分，溶劑亦然。根據(jù)相似相溶原理，使用高氯酸可以很好的提取到極性代謝物，但對酸敏感的代 謝物則不適用；在提取極性為中等偏上的代謝物時，最為廣泛的選擇是使用甲醇/水（v/v, 1/1）的混合溶劑；另外還有研究人員在實驗時會選擇使用兩相溶劑，如水/氯仿、甲醇/水/氯仿等，這類溶劑可以更有效的去除諸如脂質(zhì)類的成份，但后續(xù)處 理時需要進行溶劑分離，因此操作上相對繁瑣。

當(dāng)然，在提取的過程中，為了穩(wěn)定樣本的PH值，通常還會選擇加入磷酸緩沖溶液（比如含0.1% TSP的D2O，pH = 6.0）。詳細的制備過程可歸納如下：

i. 收集樣本；

ii. 液氮速凍研磨；

iii. 冷凍干燥得凍干粉；

iv. 稱樣（50-500 mg/個）；

v. 加提取溶劑；

vi. 渦旋30 s - 2 min，使樣本與提取溶劑混合均勻；

vii. 在室溫或冰浴條件下進行超聲萃取20 min，充分提取樣本中的代謝物；

viii. 離心取上清（若上清液渾濁，則需要進行多次離心操作）；

ix. 取800 μL上清液準備進行NMR檢測。

3、微生物樣本的制備方法

微生物種類繁多，至少有十萬種以上，但總體來說可以分為三大類，一類是真核細胞型微生物（比如真菌），一類是原核細胞型微生物（比如細菌），還有一類是非細胞型微生物（比如病毒）。本文從中選取了2個實例作為微生物樣本制備方法的參考：

a) 酵母菌樣本[6]（屬真菌類）

i. 向樣本中加入-40 ℃預(yù)凍的60%甲醇溶液（含10 mM CH3COONH4，PH = 7.5），在緩沖液保護狀態(tài)下達到滅活微生物的目的，以防止有生命的微生物在做提取時可能會改變代謝物的組成；

ii. 在干冰乙醇浴(-50 ℃)中靜置2 min，以保證滅活完全；

iii. 4000 rpm，-9 ℃下離心5 min；

iv. 去除上清液，并用1 mL含有10 mMCH3COONH4(PH = 7.5)的75%乙醇溶液作為提取溶劑；

v. 加入內(nèi)標溶液；

vi. 80 ℃水浴3 min，其中每30 s渦旋一次；

vii. 4000 rpm，-9 ℃下離心10 min；

viii. 取上清液準備進行NMR檢測。

b) 多糖降解菌群Saccharophagusdegradans[7]（屬細菌類）

i. 使用0.45 μm、直徑為30 mm的尼龍濾膜，真空過濾1 mL的該細菌培養(yǎng)液；

ii. 使用2.3%的NaCl溶液沖洗樣本，以除去殘留的培養(yǎng)液和胞外代謝物等成分，同時為了防止細胞反滲透或是細胞膜發(fā)生破碎導(dǎo)致胞內(nèi)代謝物外流，因此要避免用清水沖洗樣本；

iii. 在0 ℃下使用1 mL提取液對載有細胞的濾膜進行提?。?5 min）；

iv. 分離提取液后，再次加入1 mL提取液重復(fù)步驟iii；

v. 將iii和iv得到的提取液合并，然后在16100 rcf下離心5 min；

vi. 取上清液離心蒸發(fā)去除溶劑；

vii. 使用500 μL 50% ACN再次提取，以去除脂類及蠟；

viii. 再次離心蒸發(fā)去除溶劑。

4、其他樣本的制備方法

a) 海洋生物樣本的制備--蚌類（R. philippinarum）[8]

i. 完成實驗后馬上解剖得到內(nèi)收肌并使用液氮快速冷凍，保存于-80 ℃冰箱；

ii. 將內(nèi)收?。?00 mg）勻漿并使用4 mL/g甲醇，5.25 mL/g水和2 mL/g氯仿進行提??；

iii. 甲醇/水相被收集到玻璃瓶里并用離心蒸發(fā)儀去除溶劑；

iv. 使用600 μL 100 mM的磷酸緩沖溶液復(fù)溶（使用D2O制備并含有0.5 mM TSP，pH = 7.0）；

v. 渦旋，并在3000 g，4 ℃下離心5 min；

vi. 取550 μL樣本移入5 mm核磁管內(nèi)待測。

b) 葡萄酒[9]

酒類樣本的制備非常簡單，無需其他復(fù)雜前處理，只需對酒樣進行冷凍干燥處理，以去除樣本中過多的乙醇信號即可，但這種方法同時也會除掉樣本里的一些其它易揮發(fā)物，比如CH3COOH等。甚至有研究人員是直接選擇使用特殊脈沖序列壓制乙醇和水的信號的。

前面本文介紹了一些常見樣本大類的制備方法，內(nèi)容大多借鑒的各類已發(fā)表文獻（文獻列表已附）。下面會給大家介紹一些安隆科訊在多年的實驗室操作中所積累的實用經(jīng)驗：

1、不要在血液樣本中使用抗凝劑

在處理血液樣本時不要向血液中添加抗凝劑，因為抗凝劑的添加會使血液中的纖維蛋白無法凝結(jié)沉淀，因此所得的血漿樣本就比血清含有更多的蛋白質(zhì)，而這些蛋白質(zhì)的NMR信號會掩蓋許多其他有用的代謝物信息，不利于后面的數(shù)據(jù)分析；

2、使用Millipore超濾膜去除大分子

對于蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等含量較多的樣本，比如血清、脊髓液和組織提取液等，我們強烈建議使用Millipore超濾膜 過 濾去除3 KDa以上的大分子，然后使用更為簡單的1D NOESY序列直接進行數(shù)據(jù)采集即可。

為了更直觀的看到譜圖質(zhì)量的提升效果，我們設(shè)計了一個小實驗來做這樣一個比較：上方橙色譜圖是采用 CPMG序列（壓制大分子的信號峰）采集的一個未使用超濾膜過濾的血液樣本圖譜，而下方藍色譜圖則是采用1D NOESY序列采集的一個使用了超濾膜過濾的血液樣本圖譜。

從圖上可以非常清楚的看到，在化學(xué)位移0.5-1.5 ppm處，橙色圖譜上大分子信號非常明顯，而且掩蓋了周圍其他小分子信號的信息，但在去除這些大分子以后，在藍色圖譜上可以非常清楚的看到這些對于我們非常重要的小分子信號。

3、選擇DSS作內(nèi)標

TSP價格便宜，使用方便，因此是研究人員最常使用的內(nèi)標之一。但是TSP容易產(chǎn)生跟大分子結(jié)合的問題，會導(dǎo)致TSP本身的峰被拓寬變形，而使用DSS則可以非常好的避免這樣一些問題。

4、使用ACDSS商用標準液

安隆科訊的核磁代謝組分析技術(shù)能夠做到對代謝物的絕對定性定量分析，所以對內(nèi)標濃度的準確性有著嚴格要求。前面我們已經(jīng)闡述過建議使用DSS作內(nèi)標的原因，但由于DSS的吸水性會給準確稱量帶來困難，從而影響代謝物的絕對定量，因此我們建議研究人員使用ACDSS商用標準液 。

該標準液的濃度已通過NIST認證標樣的校準，并準確測定過PH值，使用時直接向被測樣本添加即可（建議70 μL ACDSS + 630 μL樣本）。

本文對不同樣本的制備方法給出了一個較為詳細的介紹，同時也向大家分享了安隆科訊自己積累的一些經(jīng)驗，以供代謝組學(xué)研究人員作參考。由于時間倉促， 文中有些地方可能做得不夠詳盡和完美，希望大家見諒，也歡迎大家多多給予意見和建議，可發(fā)送至support@anachro.com，謝謝！

參考文獻：

[1] Patrizia Bernini, IvanoBertini, Claudio Luchinat, etc.Standard operating procedures for pre-analytical handling of blood and urine for metabolomic studies and biobanks. J Biomol NMR, 2011(49): 231-243.

[2] Nicola Culeddu, MatildeChessa, Maria C. Porcu, etc.NMR-based metabolomic study of type 1 diabetes. Metabolomics, published online: 25 March 2012.

[3] Aifric O'Sullivan, Rodney E Willoughby, Darya Mishchuk, etc. Metabolomics of cerebrospinal fluid from humans treated for rabies. J. Proteome Res., published online: 19 Nov 2012.

[4] Ching Yu Lin, Huifeng Wu, Ronald S. Tjeerdem, etc. Evaluation of metabolite extraction strategies from tissue samples using NMR metabolomics. Metabolomics, 2007(3): 55-67.

[5] HyeKyong Kim, Young Hae Choi and Robert Verpoorte.NMR-based metabolomic analysis of plants. Nature Protocols, 2010(5): 536-549.

[6] Jennifer Christina Ewald, Stephanie Heux, and Nicola Zamboni. High-Throughput Quantitative Metabolomics: Workflow for Cultivation, Quenching, and Analysis of Yeast in a Multiple Format. Anal. Chem., 2009( 81): 3623-3629.

[7] Min Hye Shin, Do Yup Lee, Kwang-Hyeon Liu, etc. Evaluation of Sampling and Extraction Methodologies for the Global Metabolic Profiling of Saccharophagusdegradans.Anal. Chem. 2010(82): 6660-6666.

[8] Huifeng Wu, Xiaoli Liu, Jianmin Zhao, etc. NMR-Based Metabolomic Investigations on the Differential Responses in Adductor Muscles from Two Pedigrees of Manila Clam Ruditapesphilippinarum to Cadmium and Zinc. Mar. Drugs, 2011(9): 1566-1579.

[9] Young-Shick Hong. NMR-based metabolomics in wine science.(wileyonlinelibrary.com) DOI 10.1002/mrc.2832.