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賴氨酸定點偶聯技術在抗體偶聯藥物的應用
文章來源于：生物偶聯圈 作者：bob
傳統的賴氨酸偶聯ADC藥物采用非定點偶聯技術，代表性藥物有Kadcyla、Mylotarg、Besponsa。天然存在于賴氨酸側鏈中的氨基，是與單抗偶聯最方便的官能團，其不需要預先的化學修飾步驟。雖然由于其高的pKa(~10.5)，大部分蛋白質在中性pH下被質子化，但蛋白質中仍有一小部分氨基將以中性、未質子化的形式存在。賴氨酸側鏈中的氨基在親核性方面僅次于硫醇基團，但明顯領先于其他的氨基酸的側鏈(如精氨酸、絲氨酸、色氨酸、蛋氨酸)。然而由于賴氨酸的大量存在，有限數量的選擇性偶聯是非常具有挑戰性的，因此賴氨酸偶聯的ADC通常顯示出廣泛的DAR分布，例如lgG分子具有超過80個賴氨酸殘基，其中溶劑可及性高的位點超過20個。
Kadcyla 結構
但是傳統的賴氨酸偶聯ADC藥物采用非定點偶聯技術，因此產品均一性較差，這種DAR與偶聯位點的變化對臨床效果產生不良影響。為了解決這個問題，科學家提出較多賴氨酸定點偶聯技術，如選擇性修飾活性最強的賴氨酸，通過酶實現定點修飾等。
pClick技術
pClick技術是無需抗體工程或復雜的反應條件的便捷方法。這種親和肽方案由Han團隊首創，他們選用來自金黃色葡萄球菌的蛋白A的B結構域(FB蛋白)合成含非天然氨基酸的肽，由FB蛋白實現有利定位和接近，選擇性非天然氨基酸與特定賴氨酸反應。當選用曲妥珠單抗(Tras)和FB-E25FPheK(4-氟苯基氨基甲酸酯賴氨酸)突變體作為模型底物時，研究人員證明過量的FB-E25FPheK突變體進行48 h的偶聯反應可使Tras-FB偶聯物的偶聯產率>95%而單一修飾位點K337。
AJICAP技術
AJICAP技術是一類使用Fc(抗體可結晶片段)親和試劑對天然抗體進行位點特異性修飾的方法。
第1代AJICAP利用Fc親和肽試劑實現偶聯后，用三(2-羧乙基)膦[tris (2-chloroethyl) phosphate，TCEP]還原以在特定賴氨酸上安裝硫醇基團，而后用去氫抗壞血酸氧化重建因還原而裂解的抗體鏈間二硫鍵，由此成功地修飾了位點K248。
但再氧化步驟往往導致二硫鍵被擾亂與聚集性問題，所以第2代AJICAP避免了氧化還原處理，直接采用連接子裂解反應，除與K248成功偶聯外，使用具有適當間隔子的恰當Fc親和肽試劑還能合成與K288偶聯的ADC。
基于此技術，韓國公司Abtis發展的一種ADC定點偶聯技術—AbClick?。該技術平臺通過親和肽輔助，實現精準高效的抗體-藥物偶聯，在天然抗體的248位置的賴氨酸進行定點偶聯。
（圖片來源：AbTis官網）
吲哚-3-丁酸 (indole-3-butyric acid，IBA)衍生肽鄰近誘導技術
Rajagopalan團隊發現，抗體的輕鏈與重鏈之間存在著高度保守的核苷酸結合域(nucleotide binding domain，NBD)，這種存在于所有免疫球蛋白Fab(抗原結合片段)組的特性為其廣泛的應用創造了可能。通過建模分析與計算機篩選，Bilgicer團隊確定IBA對該NBD有高親和力，Kd(dissociation constant)值范圍為1~8 μmol·L?1，具體取決于抗體。于是他們設計了依靠IBA偶聯抗體核苷酸結合位點的紫外光交聯方法，并發現在紫外光不至損傷抗體活性的情況下最多能實現1.41個偶聯。
為了避免紫外光對抗體的影響，Lam團隊對親和試劑進行了優化。他們發現帶負電荷的氨基酸可增強對NBD的親和力和交聯能力，于是采用OBOC組合肽庫和新穎的篩選策略確定親和元素天冬氨酸和絲氨酸殘基(DS肽)，再結合1,5-二氟-2,4-二硝基苯以實現對核苷酸結合位點的不可逆連接。
關鍵點定向修飾技術(linchpin-directed modification，LDM)
關鍵點定向修飾技術是Rai團隊首創的，他們通過可逆的分子間反應將“關鍵點”放置在所有可及的特定氨基酸殘基上，再使另一官能團不可逆地選擇性修飾鄰近的特定基團，最后解離關鍵修飾，完成對蛋白質的特異性修飾。其中，他們使用間隔子調整以精確匹配鄰近修飾的相對方向。最初，研究人員設想通過關鍵修飾高豐度的賴氨酸來實現對低豐度氨基酸的特異性修飾，并成功獲得了選擇性良好、對腫瘤細胞抑制效果好的DAR 4的ADC。但這樣的策略很難在復雜混合物中精確修飾單個蛋白質，于是研究人員設想通過關鍵修飾半胱氨酸實現對鄰近賴氨酸特異性修飾(LDMC–K)。他們首先用TCEP處理單克隆抗體以減少二硫醚并引入游離半胱氨酸，再利用LDMC–K技術得到定點修飾的醛抗體偶聯物(antibody-aldehyde conjugate，AAC)，用美登素DM1的羥胺衍生物處理得到ADC。
賴氨酸特異性試劑
Bernardes等人也報道了特定部位的賴氨酸酰化反應。使用從計算機輔助預測的具有最低pKA的抗體賴氨酸的試劑，在略堿性pH的酰化反應將在動力學上有利的。研究發現磺酰基丙烯酸酯僅使用單摩爾當量(37℃，pH 8.0)就能快速進行反應，使得曲妥珠單抗輕鏈Lys207的定量和不可逆修飾，并完全保留天然二級結構和功能。
K-lock（K188技術）
K-lock定點偶聯技術是由Concortis Biosystems公司（被Sorrento Therapeutics收購，Sorrento 于2023年2月申請破產）開發的一種用于抗體藥物偶聯物制備的創新技術。以下是關于K-lock技術的一些關鍵點：
K188的獨特微環境：K188附近存在組氨酸（Histidine, H）和天冬氨酸（Aspartic acid, D）殘基，這些殘基改變了K188的pKa值，使其ε-氨基更容易被修飾。
氟苯酯衍生物的特異性：與傳統的N-羥基琥珀酰亞胺酯（NHS）試劑不同，氟苯酯衍生物對K188的微環境具有高度選擇性。只有在K188存在時，氟苯酯衍生物才會發生加成反應，從而實現定點偶聯。
K-lock技術已被用于多個ADC項目，比如昭華生物與杭州愛科瑞思合作的HER2靶向ADC（ZV0203）。
ZV0203結構
科倫博泰引進Sorrento技術開發的HER2靶向ADC藥物A166。
A166結構
