近年來，CRISPR技術掀起了基因組編輯的熱潮。短短一年間，CRISPR技術已登上了數個知名榜單，包括Science的十大科學突破，Nature Methods的值得關注技術，以及Technology Review的十大突破技術。利用CRISPR技術發表的文章更是層出不窮。今天就和大家分享下CRISPR實驗的主要步驟及需要考慮的因素。第一步，你要確定你做CRISPR的目的，即選一個CRISPR系統你要考慮清楚為什么要使用CRISPR系統，是破壞目的基因，還是編輯或修飾目的基因？不同的目的需要通過不同的修復途徑來實現。兩者的區別主要在于是否引入了包含外源DNA的修復模板。若只是破壞目的基因，Cas9在基因組DNA上產生的雙鏈斷鏈（DSB）通過非同源末端連接（NHEJ）途徑進行修復。這個過程會在DSB位點隨機插入或刪除幾個核苷酸，從而帶來插入缺失（Indel）。Indel可能改變目的基因的開放閱讀框，從而改變DSB下游的氨基酸序列；也可能會引入提前終止密碼子，從而破壞目的基因。由于Indel是隨機的，因此需要通過實驗來確定基因破壞的類型和程度。若是編輯或修飾目的基因，則一般利用同源修復（HR）。當合適的模板存在時，HR能在Cas9誘導的DSB上引入特定的核苷酸修飾。同樣，這個修飾也必須通過實驗來證實。第二步，設計gRNA在基因組DNA中選擇適當的目標序列，這對實驗設計來說是非常重要的一步。網上有許多關于gRNA設計的心得，這里就不多說了。第三步，將gRNA克隆到質粒中，導入CRISPR元件克隆即普通的克隆。克隆完通過測序來驗證最終的質粒產物。這一切看上去并不復雜，但若是自己動手設計，恐怕也不輕松。現在市場上一些公司已經推出了商業化的CRISPR/Cas9載體，將這些必要的元件組合成單個載體，簡化了實驗設計，例如GeneCopoeia。第四步，導入CRISPR元件在導入CRISPR元件時，若使用的是哺乳動物細胞普通的細胞系（如HeLa、HEK 293），那么常用的DNA導入方法都可以使用，如轉染、病毒導入。而對于ES細胞和iPS細胞，電穿孔的方法效果會更好。對于原代細胞，病毒轉導可能更理想。第五步，評估效果這又要回到實驗目的了。如果你是選擇修飾目的基因，那在設計所引入的外源序列時，可以加入示蹤基因。如果是選擇破壞目的基因，那你可以選擇一些檢測試劑盒。比如GeneCopoeia的IndelCheck? CRISPR/TALEN 插入缺失檢測試劑盒。其采用錯配檢測內切酶來檢測細胞內NHEJ修復期間因插入或刪除而產生的插入或缺失。試劑盒簡便快捷，性價比高。當然，你也可以通過測序對序列進行驗證。